一、实验前准备

提前准备实验所需耗材与样本，包括待测贴壁/悬浮细胞、无EDTA胰酶、预冷PBS缓冲液、试剂盒配套的结合缓冲液、Annexin V-FITC染色液、PI染色液。实验全程建议低温避光操作，避免荧光染料光照淬灭、活性失效。同时设置空白对照组、单染对照组（仅Annexin V染色、仅PI染色），用于仪器调补偿、排除实验背景干扰，保障检测数据精准度。细胞处理全程避免使用含EDTA试剂，EDTA会螯合钙离子，破坏Annexin V与细胞膜位点的特异性结合，直接导致染色失败、数据失真。

二、细胞样本处理步骤

贴壁细胞需用无EDTA胰酶消化，待细胞形态收缩、轻微脱壁后，加入完全培养基终止消化，收集细胞悬液；悬浮细胞可直接收集离心。将细胞悬液置于低速离心机，1000r/min离心5分钟，弃去上清液，去除培养基与杂质。使用预冷PBS缓冲液轻柔重悬细胞沉淀，再次离心弃上清，重复洗涤2次，彻底去除残留培养基、血清及杂质，避免干扰染色反应。最后用试剂盒配套的1×结合缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个/mL，制备合格待测细胞悬液。

三、染色操作流程

吸取100μL制备好的细胞悬液，加入流式检测管中。依次加入5μL Annexin V-FITC染色液与5μL PI染色液，轻柔吹打混匀，保证染色液与细胞充分接触。室温避光孵育10–15分钟，严格把控孵育时间，时间过短染色不充分，过长易出现非特异性染色、细胞假性凋亡。孵育完成后，立即加入400μL 1×结合缓冲液稀释混匀，终止染色反应，全程避光放置，等待上机检测。

四、上机检测与结果判定

染色完成的样本需在1小时内使用流式细胞仪上机检测，避免染料淬灭、细胞状态变化影响结果。通过仪器分析荧光信号，可精准区分四类细胞状态：左下象限为活细胞，双荧光阴性；右下象限为早期凋亡细胞，Annexin V阳性、PI阴性；右上象限为晚期凋亡细胞，双荧光阳性；左上象限为坏死细胞，Annexin V阴性、PI阳性。可直接统计各象限细胞比例，完成凋亡率定量分析。若采用荧光显微镜观测，可直接制片避光观察，清晰捕捉凋亡细胞形态与荧光分布。

五、核心使用注意事项

第一，样本处理严禁剧烈吹打、反复冻融细胞，避免人为造成细胞膜破损，引发假性坏死、假阳性结果。第二，染色必须全程避光，FITC与PI荧光染料对光照敏感，光照会快速导致染料淬灭，降低检测信号强度。第三，结合缓冲液需现用现配，优先使用1×工作液，高浓度母液需规范稀释，浓度失衡会影响蛋白结合效率。第四，样本需新鲜制备，染色后尽快上机，禁止长时间放置，防止细胞状态改变、荧光信号衰减。第五，实验全程无菌操作，避免杂菌污染样本，影响细胞活性与检测结果。第六，试剂盒需低温避光保存，试剂开封后尽快用完，避免染料失效、试剂变质，保障实验重复性。