细胞冻存的操作步骤主要包括细胞准备、消化离心、冻存液重悬、分装标记、梯度降温及液氮保存等核心环节，遵循“慢冻快融”原则以确保细胞存活率，具体流程需根据细胞类型和实验室条件调整。
操作步骤详解
1.细胞准备与预处理。
选择对数生长期（密度80%-95%）、活率＞90%且无污染的细胞，冻存前一天更换新鲜培养基。
贴壁细胞需用胰酶消化（时间依细胞类型调整，通常1-5分钟），悬浮细胞可直接离心。
2.消化与离心。
弃旧培养基，PBS缓冲液冲洗2-3次去除残留物。
加入胰酶消化至细胞脱落，用等体积完全培养基终止消化，吹打成单细胞悬液。
离心：1000-1500 rpm离心5分钟，弃上清。
3.冻存液配置与重悬。
冻存液常用配方：DMSO（5%-15%）+胎牛血清（10%-90%）+基础培养基，比例依细胞类型调整（如原代细胞可提高血清比例）。
离心后细胞沉淀加入预冷冻存液，吹打混匀，调整细胞密度至1×10⁶–5×10⁶ cells/mL。
4.分装与标记。
将细胞悬液分装至冻存管（每管1-1.5 mL），密封后标记细胞名称、日期、操作者等信息。
5.降温与保存。
程序降温盒法：冻存管放入降温盒后直接置-80℃冰箱过夜，次日转移至液氮罐（-196℃）长期保存。
梯度降温法：4℃（30-60分钟）→-20℃（2小时）→-80℃（过夜）→液氮，转移时避免温差。
短期保存（≤6个月）可用-80℃冰箱，但长期储存需液氮。
关键注意事项
1.细胞状态：仅对数生长期细胞适合冻存，密度过高或过低均影响存活率。
2.防护措施：操作液氮时戴手套和护目镜，避免冻伤；冻存管需密封防泄漏。
3.冻存液处理：DMSO需避光保存，敏感细胞可提高血清比例至50%-90%。
4.复苏原则：复苏时需快速融化（37℃水浴≤1分钟），离心去除DMSO，减少细胞损伤。
