T3 DNA 连接酶来源于 T3 噬菌体，是一种 ATP 依赖型双链 DNA 连接酶。该酶可催化双链 DNA 相邻的 5´ -磷酸基团和 3´ -羟基基团之间形成磷酸二酯键。T3 DNA 连接酶可以高效催化粘性末端、平末端和切刻位点连接（1）。与 T4 DNA 连接酶一样，在反应中加入 PEG 6000 可以提高平末端连接效率（2）。与 T4 DNA 连接酶相比，T3 DNA 连接酶在反应中对 NaCl 的耐受性更高（2 倍），因而成为需要 DNA 连接酶活性的体外分子生物学方案的通用选择。
