T7 核酸内切酶 I 能够识别并切割不完全配对的 DNA、十字形结构 DNA、Holliday 结构或交叉 DNA、异源双链 DNA,也能以较慢速度切割带切刻的双链 DNA。切割位点位于错配碱基 5´ 端的第一、第二或第三个磷酸二酯键。该蛋白是 T7 基因 3 的产物。