一、实验目的
通过低温冷冻技术保存体外培养细胞，长期维持细胞活性与生物学特性，防止细胞传代次数过多导致性状变异、污染或凋亡，为后续细胞实验、重复试验及细胞种质留存提供保障。
二、实验原理
细胞在低温环境下代谢速率会急剧降低，置于-196℃液氮环境中可近乎停止代谢，实现长期保存。细胞冻存核心原则为慢冻，通过梯度降温方式，避免细胞内外快速形成冰晶刺破细胞膜造成细胞损伤。实验常用二甲基亚砜（DMSO）作为细胞冷冻保护剂，可穿透细胞膜、提升细胞渗透压，减少冰晶生成，最大程度保护细胞完整性，提升冻存后复苏存活率。
三、实验材料与耗材
1. 细胞样本
处于对数生长期、汇合度70%~85%、无污染、无大量死细胞的贴壁或悬浮细胞。
2. 试剂
完全细胞培养基、PBS缓冲液、0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液、胎牛血清（FBS）、DMSO、商用无血清细胞冻存液（可选）。
经典冻存液配方（现配现用、预冷使用）：90%完全培养基+10%DMSO；娇贵细胞、干细胞、原代细胞可采用90%胎牛血清+10%DMSO配方，保护效果更佳。
3. 仪器与耗材
超净工作台、高速离心机、-80℃超低温冰箱、液氮罐、梯度降温冻存盒、细胞冻存管、离心管、移液枪、无菌枪头、细胞计数板、倒置显微镜。
四、详细实验步骤
第一步：实验前期准备
提前开启超净工作台紫外灭菌30min，预热离心机，将配制好的冻存液置于4℃预冷。提前观察细胞状态，确认细胞生长状态良好、形态规整、无细菌真菌污染，摒弃老化、过密、状态异常的细胞。同时准备冻存管，提前标注好细胞名称、细胞代次、冻存日期、操作人员，做好实验登记。
第二步：细胞收集
1. 贴壁细胞：弃去培养瓶中旧培养基，加入无菌PBS缓冲液轻轻清洗细胞1~2次，去除残留培养基与代谢废物。加入适量胰蛋白酶消化液，均匀覆盖细胞层面，置于培养箱中短暂消化，倒置显微镜下观察，待细胞回缩、形态变圆、少量脱落时，立即加入等量完全培养基终止消化。
2. 悬浮细胞：无需胰酶消化，直接轻轻吹打培养体系，将细胞悬液收集至无菌离心管中即可。
3. 将收集的细胞悬液轻柔吹打均匀，取样进行细胞计数，确保冻存细胞活率＞90%。
第三步：细胞离心沉淀
将细胞悬液置于离心机中，配平后以1000rpm（约220g）离心5min。离心结束后，小心吸取并弃去上清液，全程避免触碰管底细胞沉淀，防止细胞流失。
第四步：细胞重悬分装
向细胞沉淀中加入适量预冷的细胞冻存液，轻柔缓慢吹打混匀，制成均匀的细胞悬液，调整细胞密度至1×10⁶~5×10⁶个/mL。将细胞悬液按每管1mL的体积分装至提前标记好的无菌冻存管中，拧紧管盖，轻轻颠倒混匀，确保细胞分散均匀，无团聚现象。
第五步：梯度降温冻存
这是细胞冻存存活率的关键步骤，严禁直接将细胞放入液氮速冻。将分装完成的冻存管放入装有异丙醇的梯度降温冻存盒中，保证降温速率稳定为1℃/min。将冻存盒平稳放入-80℃超低温冰箱，静置冷冻12~24h。若无降温冻存盒，可采用梯度降温法：4℃放置30min→-20℃放置2h→-80℃过夜，模拟缓慢降温效果。
第六步：长期液氮保存
细胞在-80℃冰箱冷冻过夜后，细胞已完成定型冷冻，需及时转移至液氮罐气相层中长期保存。仅在-80℃保存的细胞活性会快速衰减，仅可短期存放1~3个月，长期种质留存必须液氮保存。转移过程快速轻柔，做好防护，避免冻伤与冻存管炸裂。