前期准备

1. 全程佩戴无粉手套、口罩，使用无 RNase 离心管、枪头，操作台提前擦拭 RNA 酶清除剂，防止 RNA 降解。
2. 将试剂盒内逆转录酶、RNase 抑制剂、引物、dNTP Mix 置于冰上融化；RNA 样本冰上静置解冻。
3. 提前预热水浴锅 / PCR 仪至逆转录反应温度（常规 42℃），备用。

第一步：RNA 模板变性（去除 RNA 二级结构）

1. 配制变性体系（总体系 10 μL 示例）： 总 RNA/mRNA 模板 + Oligo dT / 随机引物 + RNase-free 水
2. 轻轻吹打混匀，瞬时离心收集液体至管底。
3. 65℃水浴 5 min，完成后立即插冰上冷却 2 min，瞬时离心。

第二步：配制逆转录反应混合液

按体系依次添加以下组分（冰上操作）：

1. 第一步变性后的 RNA 混合液
2. 5× 逆转录缓冲液
3. dNTP 混合物
4. RNase 抑制剂
5. 逆转录酶 轻柔吹打混匀，低速瞬时离心，避免挂壁。

第三步：逆转录恒温合成 cDNA

1. 将离心管放入 PCR 仪，设置程序： 42℃ 孵育 30–60 min（根据试剂盒说明书调整时长）
2. 酶灭活终止反应：70℃ 加热 15 min，彻底失活逆转录酶。

第四步：产物保存与下游使用

1. 反应结束后取出，冰上冷却，瞬时离心。
2. 所得 cDNA 可直接用于普通 PCR、qPCR 实验；
3. 短期存放：-20℃保存；长期保存分装后 - 80℃冻存，避免反复冻融。

补充注意事项

1. 所有试剂、耗材严禁带入外源 RNase；
2. RNA 样本避免反复冻融，否则会降低逆转录效率；
3. 微量低浓度 RNA 样本可适当延长 42℃孵育时间，提升 cDNA 产量。