一、细胞复苏接种（初次使用培养瓶）

1、取出全新无菌细胞培养瓶，在超净台内撕开外包装，做好标记，注明细胞名称、接种日期、操作人员，避免样本混淆。

2、缓慢旋开培养瓶瓶盖，向瓶内加入适量完全培养基润瓶，轻轻晃动培养瓶，使培养基充分浸润瓶底生长面，去除瓶内微量残留杂质，随后吸出润瓶培养基，丢弃不用。

3、将复苏后的细胞悬液轻轻吹打均匀，按照合适的细胞密度接种至培养瓶内，补充足量完全培养基，轻轻吹打数次，使细胞均匀分散在培养基中，避免细胞扎堆堆积。

4、盖紧瓶盖，透气盖需轻轻旋松半圈保证气体交换，密封盖可完全拧紧；水平轻晃培养瓶，十字晃动调整细胞分布，确保细胞均匀铺于瓶底。

5、平稳移入CO₂恒温培养箱，静置培养，避免挪动、震动培养瓶，防止细胞聚集影响贴壁生长。

二、 日常换液操作

1、根据细胞生长速度、培养基变色情况进行换液，常规贴壁细胞24-48h换液一次，污染高发、细胞代谢旺盛阶段可适当缩短换液周期。

2、取出培养瓶，置于超净台内，酒精擦拭瓶身消毒，无菌操作下打开瓶盖，缓慢吸出瓶内旧培养基，全程枪头避免触碰瓶底细胞生长面。

3、加入适量无菌PBS缓冲液，轻轻晃动培养瓶，冲洗瓶底残留的代谢废物、死细胞与残留培养基，随后吸出PBS废液，重复冲洗1-2次。

4、向瓶内加入预热至37℃的新鲜完全培养基，盖好瓶盖，放回培养箱继续培养，操作全程快速无菌，减少瓶内细胞暴露空气的时间。

三、 细胞传代培养（重复使用培养瓶）

1、当细胞汇合度达到80%-90%时，即可进行传代操作。吸出旧培养基，用PBS缓冲液充分冲洗瓶底2次，去除残留血清，避免抑制胰酶消化效果。

2、向培养瓶内加入适量胰蛋白酶消化液，轻轻晃动培养瓶，使消化液完全覆盖细胞生长面，置于培养箱内短暂消化1-3min，具体时间根据细胞类型调整。

3、倒置显微镜下观察，待细胞形态变圆、少量细胞开始脱落时，立即加入等量完全培养基终止消化，血清可中和胰酶活性，避免细胞过度损伤。

4、用移液枪轻轻反复吹打瓶底细胞，将贴壁细胞完全吹落，制成均匀的单细胞悬液，转移至离心管离心，弃上清后加入新鲜培养基重悬细胞。

5、按照实验所需比例，将细胞悬液分装至新的无菌培养瓶中，补充培养基，摇匀后放入培养箱静置培养，完成传代操作。

四、培养结束后处理

1、实验结束、细胞废弃后，及时吸出培养瓶内废液，加入清水初步冲洗瓶内残留细胞与培养基。

2、加入75%酒精浸泡消毒30min以上，彻底杀灭残留微生物与细胞，随后清水反复冲洗干净。

3、倒置晾干，分类收纳，严禁重复使用破损、污染、残留杂质的培养瓶，常规一次性细胞培养瓶建议单次使用，杜绝二次复用引发污染。

五、核心使用要点与技巧

1、液面高度控制：25cm²培养瓶培养基添加量为4-6mL，75cm²为10-15mL，175cm²为25-35mL，液面过高易导致细胞缺氧、代谢缓慢，液面过低易出现培养基干涸、细胞脱水死亡。

2、透气盖使用规范：CO₂培养箱内培养必须旋松透气盖，保证瓶内与外界气体交换，维持培养基pH稳定；转运细胞、密闭培养时需拧紧瓶盖，防止漏液、污染。

3、细胞铺板均匀性：接种后禁止剧烈晃动，仅可十字轻柔摇匀，避免圆周晃动，防止细胞向瓶底中心聚集，导致局部密度过高、生长不均。

4、温度适配：所有培养基、缓冲液需提前预热至37℃，低温液体直接加入培养瓶会刺激细胞，导致细胞活性下降、贴壁不良。