琼脂糖凝胶电泳是分子生物学领域最基础、最常用的核酸分离与检测技术，凭借操作简便、分辨率适中、无毒性、适用性广等优势，广泛应用于DNA片段分离、质粒鉴定、PCR产物检测、核酸纯度与浓度初步分析等实验场景。该技术基于核酸分子的带电特性与分子筛效应实现分离，是基因克隆、分子检测、基因组分析等实验的核心前置操作。本文将系统阐述琼脂糖凝胶电泳的实验原理、材料试剂、完整操作步骤、结果分析及实验注意事项，形成标准化实验操作体系。
一、实验原理
核酸分子（DNA、RNA）在中性或弱碱性电泳缓冲液中，磷酸基团发生电离，使核酸整体带负电。在直流电场作用下，带负电的核酸分子会从电泳槽负极向正极定向迁移。琼脂糖是一种天然多糖物质，加热融化后冷却可形成具有三维网状多孔结构的凝胶，孔径大小由琼脂糖浓度决定。
电泳过程中，核酸分子的迁移速率受多重因素影响：分子片段越小、空间构象越规整，迁移速度越快；琼脂糖浓度越高，凝胶孔径越小，对小分子核酸的筛分效果越好；同时电场电压、缓冲液离子强度也会影响电泳分离效率。不同长度的核酸片段因迁移速率差异实现分离，经荧光染料染色后，可在紫外成像系统下观察到清晰的核酸条带，以此判断核酸的大小、纯度与完整性。
二、实验材料与仪器试剂
（一）实验仪器
水平琼脂糖电泳槽、稳压直流电泳仪、微波炉/恒温水浴锅、凝胶成像系统、移液枪（10μL、100μL）、电子天平、锥形瓶、移液器枪头、制胶托盘、加样梳、尺子等常规实验室器具。
（二）实验试剂
琼脂糖粉末、1×TAE电泳缓冲液（首选）/0.5×TBE电泳缓冲液、核酸荧光染料（SYBR Safe、GelRed，优先选择无毒环保染料，替代传统致癌溴化乙锭EB）、DNA样品（PCR产物、质粒、基因组DNA等）、DNA分子量标准（Marker）、6×核酸上样缓冲液。
其中，TAE缓冲液适合长片段DNA分离，分辨率高、电泳发热小；TBE缓冲液缓冲能力更强，适合短片段核酸电泳，可根据实验需求灵活选择。实验需保证配胶与电泳使用同一批次缓冲液，避免离子强度差异影响电泳效果。
三、标准化实验操作步骤
（一）凝胶浓度选择
根据待测DNA片段长度选择适配的琼脂糖凝胶浓度，是保证分离效果的关键，常用浓度适配范围如下：0.6%凝胶适用于5–20 kb大片段DNA；1.0%凝胶适用于1–10 kb常规DNA片段（最通用浓度，适配绝大多数PCR产物、质粒检测）；1.2%凝胶适用于0.5–6 kb中短片段；1.5%–2.0%凝胶适用于0.1–0.5 kb小分子DNA片段。
（二）琼脂糖凝胶配制
1. 精准称量琼脂糖粉末，按照凝胶浓度比例，将琼脂糖粉末与1×TAE缓冲液加入洁净锥形瓶中。以配制20 mL 1.0%凝胶为例，称量0.2 g琼脂糖粉末，加入20 mL 1×TAE缓冲液，轻轻摇晃混匀。
2. 溶解凝胶：将锥形瓶放入微波炉中，中火加热30–60秒，取出轻轻摇晃，重复加热2–3次，直至琼脂糖完全溶解，溶液清澈透明无颗粒，避免局部过热爆沸。若无微波炉，可采用恒温水浴锅100℃加热溶解。
3. 降温加染料：将溶解后的琼脂糖溶液置于室温或60℃水浴中冷却，待温度降至不烫手（约55–60℃）时，加入适量核酸荧光染料，充分摇匀。温度过高加染料会导致染料分解失效，温度过低会使凝胶提前凝固产生结块。
（三）倒胶凝固
1. 提前将制胶托盘、电泳槽模具清洗晾干，将托盘平稳放置在水平实验台，封闭模具两端缝隙，防止漏液。
2. 垂直插入加样梳，梳齿距离托盘底部约2 mm，不可触碰底部，避免加样孔穿透漏液。
3. 将混匀后的琼脂糖溶液缓慢倒入托盘，匀速倾倒，避免产生气泡。若表面出现微小气泡，可用枪头轻轻挑破。凝胶溶液需完全覆盖梳齿，保证加样孔规整。
4. 室温静置20–30分钟，待凝胶完全凝固、质地坚硬透明后，缓慢垂直拔出梳子，切勿左右晃动，防止加样孔破损变形。
（四）样品预处理与上样
1. 凝胶固化后，将凝胶托盘平稳放入电泳槽中，确保凝胶加样孔位于电泳槽负极一侧，向电泳槽中倒入1×TAE缓冲液，液面高出凝胶表面1–2 mm，完全浸没凝胶。
2. 样品配制：取适量DNA样品，按照样品体积5:1的比例加入6×上样缓冲液，轻轻吹打混匀。上样缓冲液可增加样品密度，使样品沉入加样孔，同时所含溴酚蓝、二甲苯青染料可作为电泳指示标记，预判电泳进程。
3. 上样操作：选用合适量程移液枪，将枪头垂直伸入加样孔上方缓冲液中，缓慢匀速将样品推入孔底，避免刺穿孔底凝胶、溢出样品。每更换一组样品必须更换新枪头，防止样品交叉污染。预留单独泳道加入DNA Marker，用于后续分子量对照。常规单孔上样量为5–10 μL，根据样品浓度可适当调整。
（五）电泳分离
1. 盖紧电泳槽盖子，确认电极连接正确，负极对应加样孔端，正极对应凝胶另一端，避免电极接反导致核酸反向迁移。
2. 开启电泳仪，设置稳压模式，常规1.0%凝胶电泳电压设置为100–120 V，电流稳定在40–60 mA。低浓度凝胶可适当降低电压，高浓度凝胶可微调升压，保证电泳匀速进行。
3. 观察电泳进程，待溴酚蓝指示条带迁移至凝胶全长75%–80%位置，距离凝胶前沿约1–2 cm时，关闭电源，停止电泳，全程约30–40分钟，避免核酸条带跑出凝胶导致实验失效。
（六）成像检测与结果记录
1. 电泳结束后，取出凝胶，轻轻沥干表面多余缓冲液，将凝胶平稳放入凝胶成像系统托盘，关闭遮光舱门。
2. 开启紫外光源，调整成像参数，观察核酸条带位置、数量、亮度与清晰度，拍摄清晰成像图片并保存记录。
四、实验结果分析
1. 分子量判断：将样品条带迁移位置与DNA Marker条带对比，根据Marker已知片段大小，估算待测核酸分子的分子量，片段越大，迁移距离越近，条带位置越靠上。
2. 纯度分析：单一清晰、无拖尾、无杂带的条带，说明核酸样品纯度较高、完整性良好；若条带模糊、弥散拖尾，提示核酸存在降解；若出现多条杂带，说明样品存在非特异性产物或杂质污染。
3. 浓度初步判断：在上样量一致的前提下，条带亮度越高、越厚实，代表核酸样品浓度越高；条带暗淡微弱，说明样品浓度较低。
