细胞冷冻实验是通过特定的冷冻技术和保护剂，将细胞置于低温环境（-80℃或液氮）中，抑制细胞代谢，实现长期保存的实验方法。核心作用是长期保存细胞系、减少细胞传代过程中的变异和损耗、备份珍贵细胞（如原代细胞、工程细胞），是细胞培养实验中不可或缺的关键步骤——做好细胞冷冻，才能避免“养细胞半月，冻存一天全白费”的尴尬。分4个模块（冻前准备、冷冻操作、冻后储存、复温复苏）。

1.冻前准备

（1）细胞准备

选择对数生长期的细胞（活性最高，冻存后复苏率高），提前1-2天换液，确保细胞汇合度达到70%-80%，无污染、长势良好。

（2）试剂准备

配制冻存液（常用比例：培养基70%+血清20%+DMSO 10%，DMSO为细胞保护剂，需提前预冷），准备冻存管、离心机、移液枪等无菌器材。

（3）环境准备

无菌操作台消毒，提前预冷离心机、冻存盒（程序降温盒），确保操作环境无菌、温度达标。

2.冷冻操作

（1）细胞收集

消化对数生长期的细胞，离心（1000r/min，5min），弃上清液，轻轻吹打细胞沉淀，制成单细胞悬液。

（2）加冻存液

缓慢加入预冷的冻存液，轻轻吹打混匀，避免剧烈震荡损伤细胞。

（3）分装与标记

将细胞悬液分装至冻存管（每管1-2ml），拧紧管盖，标记细胞名称、冻存日期、操作者。

（4）程序降温

将冻存管放入程序降温盒，置于-80℃冰箱过夜（缓慢降温，速率约1℃/min），避免直接放入-80℃导致细胞内形成冰晶。

3.冻后储存

（1）短期储存

-80℃冰箱可保存1-3个月，期间避免反复开关冰箱门，防止温度波动。

（2）长期储存

过夜降温后，将冻存管转移至液氮罐（-196℃）中保存，转移过程动作要快，避免冻存管升温。

4.复温复苏

（1）快速复温

从液氮罐中取出冻存管，立即放入37℃水浴锅中，快速摇晃，1-2min内完全解冻（避免缓慢解冻形成冰晶，损伤细胞）。

（2）无菌处理

解冻后，将细胞悬液缓慢加入预温的培养基中，轻轻混匀，离心（1000r/min，5min），弃上清液（去除DMSO，避免DMSO损伤细胞）。

（3）复苏培养

加入新鲜培养基，轻轻吹打混匀，接种至培养瓶，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，24h后换液，观察细胞贴壁和生长情况。