（一）实验前准备

1.无菌处理：将冻存管、离心管、移液管、枪头等耗材放入高压蒸汽灭菌锅灭菌，冷却后放入超净工作台备用；实验台面用酒精棉片擦拭消毒，实验人员穿戴无菌手套、实验服。

2.试剂准备：提前配制细胞冻存液，按比例混合DMSO、胎牛血清与基础培养基，轻轻颠倒混匀（避免剧烈震荡），置于4℃预冷30min；将PBS、胰酶、基础培养基置于室温复温，避免温度骤变影响细胞。

3.细胞准备：选取处于对数生长期的细胞（细胞汇合度70%-80%），此时细胞活性最强，冻存后复苏成功率最高；若为贴壁细胞，提前移除培养瓶中的旧培养基，用PBS洗涤2次，去除残留培养基。

（二）细胞消化与收集（贴壁细胞）

1.向培养瓶中加入适量0.25%胰酶-EDTA溶液，覆盖细胞表面，放入37℃恒温水浴锅孵育2-3min，期间在显微镜下观察，直至细胞变圆、脱落。

2.加入适量基础培养基，终止胰酶消化（培养基体积为胰酶体积的2-3倍），用移液管轻轻吹打细胞，使细胞分散为单细胞悬液，避免用力吹打导致细胞损伤。

3.将细胞悬液转移至15mL离心管中，设置离心机转速1000-1500r/min，离心5-10min，收集细胞沉淀。

4.离心结束后，缓慢倒掉上清液，用PBS洗涤细胞沉淀1次，再次离心（相同转速与时间），彻底去除残留胰酶与旧培养基。

（三）细胞冻存液重悬与分装

1.向离心管中的细胞沉淀中，加入预冷的细胞冻存液，轻轻吹打混匀，使细胞均匀分散在冻存液中，细胞浓度控制在1×10^6-1×10^7个/mL（浓度过高或过低都会影响复苏效果）。

2.将配制好的细胞悬液，缓慢分装至提前标记好的冻存管中，每管分装1-1.5mL（避免装液过满，预留膨胀空间），分装后轻轻颠倒冻存管3-5次，确保细胞与冻存液充分混匀。

3.将冻存管盖子拧紧，用酒精棉片擦拭冻存管表面，去除残留液体，再次核对标记信息，避免混淆。

（四）梯度降温冻存

1.将冻存管放入4℃冰箱，静置30min，让细胞逐步适应低温环境，减少温度骤变损伤

2.将冻存管转移至-20℃冰箱，静置2h，进一步降低细胞温度，缓慢形成微小冰晶（避免快速冷冻形成大冰晶）