细胞分离液是一种密度梯度介质,通常由多糖(如Ficoll)、硅胶颗粒(如Percoll)或其他高分子聚合物配制而成。它的核心原理是利用密度差异——不同种类的细胞具有不同的密度,在离心力作用下,细胞会根据自身密度在分离液中重新分布,形成不同的细胞层。
最经典的外周血单个核细胞分离液,能将淋巴细胞、单核细胞与红细胞、粒细胞分开。不通过红细胞沉降,可避免粒细胞混入。
是可以分离特定密度细胞的分离液(1.077, 1.084 和 1.073 g/mL 三款),适于已知密度细胞的分离。
由聚乙烯吡咯烷酮包被的硅胶颗粒组成,可以形成连续或不连续的密度梯度,适合分离密度相近的细胞亚群,如NK细胞、树突状细胞等。
可分为Percoll和Percoll PLUS,Percoll是PVP涂层硅胶介质,Percoll PLUS是共价偶联烷硅涂层硅胶介质,性质更加稳定。
Percoll PLUS内毒素含量较低(<2EU/ml),有法规文件(RSF 文件)支持,可以用于临床研究,Percoll 仅能用于科研。
细胞分离液的操作方法:
先用9份分离液与1份8.5% NaCl或1.5MPBS混合达到生理性渗透压,然后用生理溶液稀释到所需浓度。
先将试管壁用牛血清湿润,除去多余血清,这种预处理可使逐层叠加的液平稳沿管壁流下,使形成满意的界面。
在制备过程中一般用长针头注射器从高密度向低密度逐层放置,有时相邻两层比重相差不大时,可将液放入注射器中,小针头斜面紧贴管壁,任其自然慢慢流下。
样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异,一般加样体积不宜过大,细胞浓度也不可过高,否则会影响细胞的分离和回收。
一般采用离心力为400g,时间20~25min。
由于多层之间密度差别不大,因此离心机加速、降速时要慢,要平稳。
当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时,可逐层去除液后收集界面部位的细胞;有时大部分细胞位于层中,则需要逐层收集。收获含有液的细胞经2次洗涤后可供培养或检测用。
